انواع فلوسایتومترها

فلوسایتومترهای سنتی یا اولیه (Traditional Flow Cytometers)

فلوسیتومترهای سنتی از سه سیستم فلوئیدیک (fluidics)، اپتیک (optics) و الکترونیک (electronics) تشکیل شده اند. سیستم فلوئیدیک شامل sheath fluid (مایع غلافی) است که تحت فشار قرار می‌گیرد تا نمونه را به نقطه رهگیری لیزری (laser intercept) یا نقطه بازرسی (interrogation point) که در آن نمونه تجزیه و تحلیل می‌شود، برساند و متمرکز کند.

سیستم نوری شامل اپتیک‌های تحریکی (لیزر) و اپتیک‌های جمع آوری (لوله‌های photomultiplier یا PMT و فوتودیود و …) است که سیگنال‌های نور مرئی و فلورسنت مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل نمونه را تولید می‌کند. مجموعه‌ای از فیلترهایdichroic ، نور فلورسنت را به دیتکتورهای خاص هدایت می‌کنند و فیلترهای باند گذر (bandpass filters)، طول موج‌های نور خوانده شده را تعیین می‌کنند تا هر فلوروکروم (fluorochrome) را جداگانه بتوان تشخیص داد و اندازه گیری کرد. به طور خاص، فیلترهای دو رنگ یا dichroic فیلترهایی هستند که نور را با طول موجی خاص عبور می‌دهند و نور باقی‌مانده را در یک زاویه منعکس می‌کنند. به عنوان مثال، یک فیلتر 450 Dichroic Long Pass (DLP) به نوری که طول موج بیشتری از 450 نانومتر دارد اجازه می‌دهد از فیلتر عبور کند و طول موج‌های کوتاه‌تر نور را با زاویه‌ای منعکس کند تا به آشکارساز دیگری ارسال شود. فیلترهای باند گذر یک بازه کوچک با طول موج خاصی از نور را تشخیص می‌دهند. به عنوان مثال، یک فیلتر bandpass   (450/50) فلورسنت را با طول موج 450 نانومتر (25 نانومتر بیشتر و کمتر) از فیلتر عبور می‌دهد تا توسط دیتکتور خوانده شود.

سیستم الکترونیکی سیگنال‌های دیتکتورها را به سیگنال‌های دیجیتالی تبدیل می‌کند که توسط کامپیوتر قابل خواندن هستند. سیستم‌های لیزری چندگانه با ابزارهایی که تا 20 پارامتر (FSC، SSC و 18 دیتکتور فلورسنت) هستند، رایج اند. پلتفرم‌های ابزاری جدیدی با پنج لیزر یا بیشتر و 30 تا 50 پارامتر معرفی شده‌اند. رایج ترین لیزرهای مورد استفاده در فلوسیتومترهای سنتی 488 نانومتر (آبی)، 405 نانومتر (بنفش)، 532 نانومتر (سبز)، 552 نانومتر (سبز)، 561 نانومتر (سبز-زرد)، 640 نانومتر (قرمز) و 355 نانومتر (فرابنفش) هستند.

علاوه بر این، ابزارهایی وجود دارند به نام avalanche photodiodes  (APD)که برای تشخیص فلورسانس با هدف افزایش حساسیت، جایگزین PMT‌ها شده‌اند.

انواع سایتومترها

• سایتومترهای فوکوس آکوستیک (Acoustic Focusing Cytometers)

این سیتومتر از امواج اولتراسونیک (ultrasonic waves) برای تمرکز بهتر سلول‌ها برای بازیابی لیزری استفاده می‌کند. این نوع فوکوس صوتی امکان ورودی نمونه بالاتر و گرفتگی کمتر نمونه را فراهم می‌کند. این سیتومتر می‌تواند از 4 لیزر و 14 کانال فلورسانس استفاده کند.

• جدا‌کننده‌های سلولی (Cell Sorters)

نوع خاصی از فلوسایتومتر سنتی، مرتب‌کننده سلولی است که می‌تواند نمونه‌ها را برای تجزیه و تحلیل بیشتر خالص‌سازی و جمع‌آوری کند. مرتب‌ساز سلولی (cell sorter) به کاربر اجازه می‌دهد تا (gate) را روی جمعیتی از سلول‌ها یا ذرات که از نظر داشتن پارامترهای مورد نظر مثبت (یا منفی) هستند، انتخاب کرده و سپس آن سلول‌ها را به یک ظرف جمع‌آوری هدایت کند. سل سورتر‌ها، سلول‌ها را با نوسان دادن جریان (Stream Vibration) نمونه مایع در فرکانس بالا برای تولید قطرات از هم جدا می‌کند. سپس به قطرات بار مثبت یا منفی داده می‌شود و آن‌ها از میان صفحات انحراف فلزی عبور می‌کنند و بر اساس بار خود به یک ظرف جمع‌آوری خاص هدایت می‌شوند. مخازن جمع آوری می‌توانند لوله، اسلاید یا صفحه باشند (96 چاهک یا 384 چاهک معمول هستند).

دو نوع دسته‌بندی سلولی وجود دارد، کووت کوارتز (quartz cuvette) و ” jet-in-air” که در محل قرارگیری نقطه بازیابی لیزری متفاوت هستند. مرتب‌کننده‌های سلول کووت کوارتز دارای تراز لیزری ثابت هستند و برای مرتب‌سازی آسان‌تر آماده می‌شوند. مرتب‌کننده‌های سلولی « jet-in-air» باید لیزرها را روزانه تنظیم کنند و راه ‌اندازی آن‌ها دشوارتر است اما برای تشخیص ذرات کوچک سازگارتر هستند.

• سایتومترهای تصویربرداری (Imaging Cytometers)

فلوسیتومترهای تصویربرداری (IFC یا Imaging flow cytometers) فلوسایتومتری سنتی را با میکروسکوپ فلورسانس ترکیب می‌کنند. این کار امکان تجزیه و تحلیل سریع نمونه را برای مورفولوژی و فلورسانس چند پارامتری در سطح تک سلولی و جمعیتی فراهم می‌کند.   IFC می‌تواند توزیع پروتئین را در سلول‌های منفرد مانند میکروسکوپ کانفوکال (confocal) یا فلورسانس (fluorescence) و همچنین برای پردازش تعداد زیادی سلول مانند فلوسایتومتر ردیابی کند. آن‌ها به ویژه در کاربردهای متعددی مانند سیگنالینگ سلولی، مطالعات co-localization، برهمکنش سلول به سلول، آسیب و ترمیم DNA و هر برنامه کاربردی که نیاز به هماهنگی مکان سلولی با بیان فلورسانس در جمعیت‌های بزرگ سلولی دارد، مفید هستند.

• سایتومترهای جرمی (Mass Cytometers)

سایتومترهای جرمی، طیف سنجی جرمی (time-of-flight) و فلوسایتومتری را ترکیب می‌کنند. سلول‌ها به جای آنتی‌بادی‌های نشان‌دار فلورسنت، با آنتی‌بادی‌های دارای نشان یون فلز سنگین (معمولاً از سری لانتانید) برچسب ‌گذاری شده و با استفاده از طیف‌سنجی جرمی شناسایی می‌شوند. سایتومترهای جرمی دارای تشخیص نور FSC یا SSC نیستند که روش مرسوم تشخیص توده‌های سلولی را امکان پذیر نمی‌کند. با این حال می‌توان از روش‌های دیگری مانند بارکدگذاری سلولی (cell barcoding) برای این منظور استفاده کرد. همچنین، سایتومتری جرمی سیگنال‌های اتوفلورسانس (autofluoresce) سلولی ندارد و معرف‌ها (reagents) همپوشانی طیفی انتشار مرتبط با برچسب‌های فلورسنت را ندارند، بنابراین نیازی به compensation (فرآیند تصحیح سرریز فلورسانس، به عنوان مثال: حذف سیگنال هر فلوروکروم معین از همه آشکارسازها به جز آشکارسازی که به اندازه‌گیری آن رنگ اختصاص دارد) نیست.

با این حال، نمونه در طول تجزیه و تحلیل از بین می‌رود، بنابراین مرتب سازی سلول امکان پذیر نیست و acquisition rate بسیار کمتر از یک فلوسیتومتر استاندارد است (1000 سلول در ثانیه به جای 10000 سلول در ثانیه). در حال حاضر، معرف‌های تجاری برای 40 کانال وجود دارد اما این تعداد با معرفی یون‌های فلزی دیگر مانند پلاتین برای ترکیب با آنتی‌بادی‌ها افزایش می‌یابد.

• سایتومتر برای تجزیه و تحلیل آرایه بید (Bead Array Analysis)

 Multiplex bead arrays برای تجزیه و تحلیل مقادیر زیادی از آنالیت‌ها در حجم نمونه‌های کوچک محبوب شده اند. به طور خلاصه، این سنجش‌ها از دانه‌های جذبی با مقدار مشخصی از فلورسانس در یک کانال خاص و یک مولکول گزارشگر که توسط لیزر جداگانه شناسایی می‌شود برای تعیین کمیت مقدار آنالیت جذب شده مرتبط با Bead  خاص استفاده می‌کنند. این تکنیک در اصل معادل 100 سنجش الایزا است.

فلوسایتومترهای کوچک معمولاً دارای 2 لیزر و loader 96 چاهکی برای تجزیه و تحلیل این سنجش‌ها ایجاد شده اند. این ابزارها دارای footprints و optical bench designs هستند که برای تشخیص و شناسایی مهره‌هایی (بید) با مقادیر مختلف فلورسانس در طول دو کانال بهینه شده‌اند. ابزارهایی ساخته شده اند که می‌توانند 100 تا 500 ترکیب مختلف Bead  را تشخیص دهند.

• آنالایزرهای طیفی (Spectral Analyzers)

یکی از چالش‌های فلوسایتومتری چند پارامتری (multi-parameter flow cytometry)، تصحیح کردن همپوشانی طیفی (compensation) بین فلوروکروم‌ها است. نوع جدیدی از فلوسایتومتر، آنالایزر طیفی است که به طور خاص برای رفع این مشکل طراحی شده است. یک آنالایزر اسپکترال کل طیف انتشار فلورسنت را برای هر فلوروکروم در یک نمونه چند رنگ اندازه می‌گیرد تا اثر انگشت طیفی (spectral fingerprint) ایجاد کند. سپس در طول تجزیه و تحلیل، هر طیف برای ارائه یک سیگنال خالص برای هر فلوروکروم مخلوط نمی‌شود. تجزیه و تحلیل طیفی شروع به جایگزینی PMT‌های سنتی به عنوان یک روش تشخیص برای فلوسایتومتری با ابعاد بالا کرده است.

تفاوت فلوسایتومتری سنتی با full spectrum

فناوری‌های جدید آشکارساز

لوله‌های تقویت کننده نوری (PMTs یا Photomultiplier tubes) فناوری دیتکتور استاندارد برای فلوسایتومتری هستند. حساسیت بالا و پس‌زمینه کم، آن‌ها را برای فناوری فلورسانس مفید می‌کند. با این حال، آشکارسازهای حالت جامد (solid state detectors) در برخی از سیتومترها ظاهر می‌شوند. فتودیودهای Avalanche (APD) ارزان، حساس و بسیار خطی هستند و در ناحیه قرمز طولانی (long red region) پاسخ طیفی بیشتری دارند. فتودیودهای سیلیکونی (SiPD یا Silicon photodiodes) نیز یک گزینه امیدوار کننده برای آشکارسازهای حالت جامد هستند.