چرخه سلولی

رشد، تکثیر و تقسیم سلولی در سلول‌های یوکاریوتی بر اساس یک سری رویدادهای بسیار کنترل شده به نام چرخه سلولی رخ می‌دهد. در ایمنی اکتسابی (adaptive immunity)، لنفوسیت‌های T و B اختصاصی در پاسخ به تحریک آنتی ژنی خارجی، تحت گسترش کلونال (تقسیم، تکثیر و تمایز) قرار می‌گیرند. فلوسایتومتری، ایمونوفلورسانس یا ایمونوهیستوشیمی را می‌توان برای تعیین آسان وضعیت چرخه سلولی استفاده کرد.

مروری بر چرخه سلولی و تکثیر سلولی

برای کمک به محققان برای درک بهتر مکانیسم‌های سلولی اساسی درگیر در ایمنی، التهاب، خون ‌سازی، نئوپلازی (neoplasia) و سایر پاسخ‌های بیولوژیکی، طیف وسیعی از ابزارها از جمله آنتی‌بادی‌ها، کیت‌ها و سیستم‌ها را برای اندازه‌ گیری پاسخ‌های پرولیفراتیو ارائه می‌شوند.

با استفاده از فلوسایتومتری، ایمونوفلورسانس یا ایمونوهیستوشیمی، محققان می‌توانند به سرعت و با دقت وضعیت چرخه سلولی یا محل بافت سلول‌های منفرد را در جمعیت‌های در حال تکثیر تعیین کنند. این ابزارها عبارتند از:

• معرف‌ها و کیت‌هایی برای تجزیه و تحلیل محتوای DNA سلولی
• رنگ‌های DNA شامل پروپیدیوم یدید (PI)،  7-آمینواکتینومایسین D (7-AAD)، 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) و موارد دیگر
• آنتی بادی علیه سایکلین‌ها (cyclins)، رتینوبلاستوما (retinoblastoma) و هیستون H3 فسفریله

در ایمنی اکتسابی، لنفوسیت‌های T و B اختصاصی در پاسخ به تحریک آنتی ژنی خارجی، تحت گسترش کلونال قرار می‌گیرند. رشد، تکثیر و تقسیم سلولی در سلول‌های یوکاریوتی بر اساس یک سری رویدادهای بسیار کنترل شده به نام چرخه سلولی رخ می‌دهد.

چرخه سلولی

چرخه سلولی دارای دو فاز اصلی است: اینترفاز (interphase) که فاز بین رویدادهای میتوزی است و فاز میتوزی (mitotic phase) که در آن سلول مادر به دو سلول دختر که از نظر ژنتیکی یکسان اند، تقسیم می‌شود. اینترفاز دارای سه مرحله متمایز و متوالی است. در مرحله اول به نام G1، سلول‌ها محیط خود را زیر نظر دارند و هنگامی که سیگنال‌های لازم دریافت می‌شود، سلول‌ها RNA و پروتئین‌ها را برای القای رشد سنتز می‌کنند. وقتی شرایط مناسب باشد، سلول‌ها وارد مرحله S چرخه سلولی می‌شوند و به سنتز DNA و تکثیر DNA کروموزومی خود می‌پردازند. در نهایت، در فاز G2، سلول‌ها به رشد خود ادامه می‌دهند و برای میتوز آماده می‌شوند.

تجزیه و تحلیل محتوای DNA سلولی

طیف گسترده ای از معرف‌ها را برای مطالعه چرخه سلولی وجود دارد. معرف‌ها شامل رنگ‌های اسید نوکلئیک (نوکلئوفیل) مانند پروپیدیوم یدید (PI) و 7-آمینواکتینومایسین D (7-AAD) می‌باشند. علاوه بر این، نوعی کیت معرف شامل PI و سایر معرف‌ها برای تجزیه پروتئین‌ها و RNA است تا امکان اندازه‌ گیری دقیق‌تر DNA را فراهم کند. نمونه‌ها متعاقباً با استفاده از فلوسایتومتری برای ارزیابی پلوئیدی، شناسایی ساقه‌های DNA غیر طبیعی و تخمین شاخص DNA (DI) و توزیع فاز چرخه سلولی لاین‌های بنیادی تجزیه و تحلیل می‌شوند. در طول مراحل چرخه سلولی، سطوح DNA تغییر کرده و استفاده از رنگ‌های DNA مانند 7-AAD را برای تولید پروفایل‌های مشخصه محتوای DNA سلولی تسهیل می‌کند (شکل زیر را ببینید).

همان طور که سلول‌ها مراحل چرخه سلولی را طی می‌کنند، پروتئین‌هایی مانند هیستون H3 Ser28 تغییر یافته یا در بیان آن‌ها تغییراتی ایجاد می‌شود. برای تسهیل تکثیر DNA، هیستون اصلاح شده و کروماتین را باز می‌کند تا اجازه ورود ماشین‌های همانند سازی را بدهد. برای حمایت بیشتر از مطالعه چرخه سلولی، آنتی‌بادی‌هایی برای این پروتئین‌ها ساخته می‌شوند تا برای تصویر برداری یا کاربردهای فلوسیتومتری استفاده شوند.

 شکل 1.سلول های طحال موش غنی شده با CD4 با anti-CD3/CD28، IL-2 و IL-4 به مدت 6 روز کشت داده شدند. سلول ها برداشت و با 10 نانوگرم در میلی لیتر IL-2+1 میکروگرم در میلی لیتر کولسمید به مدت 4 (چپ) یا 24 (راست) ساعت تیمار شدند و با کیت معرف DNA  رنگ آمیزی شدند. تجزیه و تحلیل چرخه سلولی جمعیت رنگ آمیزی شده برای سطوح BrdU و DNA کل (7-AAD).

PBMCهای انسانی با anti-CD3/CD28 به مدت 48 ساعت تحریک شدند و با PMA+ionomycin به مدت 4 ساعت مجدداً تحریک شدند و BrdU برای 1 ساعت آخر اضافه شد. سپس سلول‌ها با استفاده از پروتکل رنگ‌آمیزی BrdU برداشت و رنگ‌آمیزی شدند. گیت R3 حاوی سلول های فاز G0، گیت R4 حاوی سلول های فاز S، گیت R5 حاوی سلول های فاز G2/M، و گیت R6 حاوی سلول های آپوپتوز یا نکروز است که شروع به از دست دادن محتوای اسید نوکلئیک می کنند.

منبع

https://www.bdbiosciences.com/en-us/learn/research/cell-biology/cell-cycle