آپاپتوز را میتوان به کمک تکنیک های مختلفی سنجش کرد که در این مقاله به آن ها اشاره می شود.
سنجش آپاپتوز:
آپوپتوز به عنوان یک نوع مرگ سلولی برنامه ریزی شده مرتبط با تغییرات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی مشخص در سلول ها شناخته شده است. این مرگ برنامه ریزی شده سلولی نقش مهمی در پیدایش تعدادی از فرآیندهای فیزیولوژیک و پاتولوژیک ایفا می کند و بروز بیش از حد یا کاهش آن میتواند منجر به بروز بیماریهای مختلف شود. تشخیص علائم آپوپتوز به منظور بهبود و احتمال کاهش یا حتی ممانعت از پیشرفت این گونه بیماریها بسیار ضروری است. بنابراین، به دست آوردن بینش در مورد تکنیکهای تشخیص سلولهای آپوپتوتیک امکان توسعه رویکردهای درمانی مؤثرتر و کاربردیتر را فراهم میکند. علاوه بر این، تشخیص آپوپتوز یک شاخص مهم در آزمایش داروهای جدید بالقوه و سمیت سلولی موادشیمیایی محسوب می شود.
بروز آپوپتوز تغییرات مورفولوژیکی و ایجاد آبشار بیوشیمیایی در سلول ها رادر پی دارد. تغییرات مورفولوژیکی شامل انقباض و تراکم سلول ها، افزایش تراکم سیتوپلاسم، واپاشی پوشش هسته و تشکیل اجسام آپوپتوتیک است. در حالی که قطعه قطعه شدن DNA، برش پروتئین ها و اتصال متقابل پروتئین ها به عنوان علائم بیوشیمیایی آپوپتوز در نظر گرفته میشوند. نهایتا، دانستن تفاوت های ظریف نوع مرگ سلولی ناشی از یک فرآیند یا ماده، می تواند به رمزگشایی اینکه کدام درمان برای بیماریهای خاص مؤثرتر است کمک کند.
طبقه بندی روش های تشخیص مرگ سلولی برنامه ریزی شده
Membrane permeability/damage detection methods
Annexin V binding assay
Lactate dehydrogenase assay
Electrochemical methods
Mitochondrial damage/alteration detection methods
MTT and XTT assay
Mitochondrial membrane potential detection
Mitochondrial activity of streptolysin O permeabilized cells assay
Cytochrome c release detection
Caspase activity detection methods
ELISA
Fluorometric and colorimetric assays
Immunohistochemical methods
Laser and mass spectroscopic methods
DNA fragmentation/denaturation/condensation detection methods
APO ssDNA assay
TUNEL assay
ISEL
ELISA
Gel electrophoresis-based methods
DNA-specific fluorochrome based methods
Clinical evaluation
روش های بررسی آسیب/ نفوذپذیری غشا:
افزایش نفوذپذیری غشای سلولی در شروع مرگ برنامه ریزی شده سلولی اتفاق می افتد. سلول شروع به چروک شدن و تورم میکند که نفوذپذیری و مورفولوژی غشای سلولی را تغییر می دهد.
Annexin V binding assay
سنجش اتصال Annexin V عمدتاً یک تکنیک ثابت برای شناسایی و کمی سازی سلول های آپوپتوتیک میباشد. Annexin V یک پروتئین متصل به فسفولیپید وابسته به کلسیم است که تمایل بالایی برای اتصال به فسفاتیدیل سرین (PS) دارد.
PS در سلول های سالم در سمت سیتوزولی غشای پلاسمایی قرار دارد. در شروع آپوپتوز ، PS به سمت خارج سلولی غشاء منتقل میشود. این جابجایی PS از طریق اتصال آن با Annexin V متصل به فلورسنت، شناسایی میشود. Annexin V معمولاً همراه با (7-amino-actinomycin) 7-ADD یا (propidium iodide) PI استفاده میشود که فقط میتوانند به اسیدهای نوکلئیک متصل شوند و بین مراحل آپوپتوز تمایز ایجاد میکنند.
پروتکل Annexin V/PI یک رویکرد رایج برای مطالعه سلول های آپوپتوتیک است. PI فقط سلولهای مرده و آپوپتیک دیررس را رنگ میکند، زیرا تنها وارد سلولهایی میشود که غشا آنها نفوذپذیر شدهاست. PI به اسیدهاینوکلئیک متصل میشود و فلوئورسانس قرمز ساطع میکند.
سلولهای آپوپتوتیک برای رنگ آمیزی Annexin V از طریق فلوسیتومتری مثبت هستند. با اینحال، به دلیل افزایش نفوذپذیری غشاء در سلولهای پیروپتوتیک، PI و Annexin V هر دو برای رنگآمیزی PS و DNA میتوانند وارد سلول شوند، و از هر دو نظر مثبت میشوند. سلول های نکروتیک نیز میتوانند به دلیل پارگی غشاء از نظر هر دو مورد مثبت شوند.
پدیده اتصال Annexin V وابسته به کلسیم، که تمایل بالایی به باقیماندههای PS نشان میدهد، میتواند با استفاده از کیتهای موجود تجاری انجامشود و از طریق فلوسیتومتری، میکروسکوپ (نوری یا فلوورسانس) ردیابی شود.
Lactate dehydrogenase assay
لاکتات دهیدروژناز (LDH) زمانی در فضای خارج سلولی دیده میشود که نفوذپذیری غشای سلولی مختل شود یا غشای سلولی آسیب ببیند. درواقع، LDH یک آنزیم سیتوزولی است که در تمام سلول های زنده وجود دارد و فقط در محیط خارج سلولی درنتیجه آسیب سلولی به دلیل نکروپتوز و پیروپتوز ظاهر میشود. زیرا در لیزسلولی، محتویات سیتوپلاسمی از جمله آنزیم LDH آزاد میشوند.
سنجش LDH هم به صورت رنگسنجی و هم فلوئورومتریک میتواند انجام شود.
Electrochemical methods
انواع مختلفی از دستگاه های الکتروشیمیایی برای تشخیص مرگ برنامه ریزی شده سلولی وجود دارد.
روشهای تشخیص آسیب/ تغییر میتوکندری:
تغییرات مختلف میتوکندریها، نشاندهنده سمیتسلولی است. روشهای تشخیص زیر نشاندهنده تغییر/ آسیب در میتوکندری در طول مرگ برنامهریزیشده سلولی است.
MTT and XTT assay
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) وXTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide ) جز نمک های تترازولیوم می باشند. MTT و XTT برای شناسایی سلولهای زنده در بین سلولهای مرده استفاده میشوند و هر دو برای اندازهگیری سمیت سلولی دارو یا ترکیبات مختلف کارآمد هستند.
Mitochondrial membrane potential detection
ازدست دادنMMP (mitochondrial membrane potential) که به طور نمادین به عنوان Δψm نشان دادهمیشود، ممکن است نشانه اولیه مرگ سلولی نباشد، اما در نتیجه سیگنال مرگ اتفاق میافتد. بازشدن منافذ انتقالی میتوکندری باعث دپلاریزاسیون غشا ترانسممبران و آزادسازی عوامل آپوپتوز مانند AIF (apoptosis-inducing factor) و از دست دادن فسفریلاسیون اکسیداتیو میشود. آزادسازی سیتوکروم c ممکن است به MMP وابسته نباشد، اما انتشار AIF حتما به آن وابسته است.
PTP (permeability transition pore) یک مگا-کانال است که تصور میشود منبع آزادسازی عوامل آپوپتوتیک مختلف و علت TMP (transmembrane potential) باشد. برای تشخیص MMP و TMP، چندین رنگ چربی دوست و کاتیونی نفوذپذیر از غشاء مانند DiOC6 ، Rh123، TMRM and TMRE، JC-1، و CMX-Ros موجود است. همه این رنگ ها را می توان به صورت کیفی در میکروسکوپ فوئورسانس یا از نظر کمی در فلوسیتومتری یا اسپکتروفتومتری میکروپلیتی استفاده کرد.
هنگامی که آپوپتوز شروع میشود، غشای خارجی میتوکندری گرادیان الکتروشیمیایی خود را از دست میدهد و رنگ کاتیونی شروع به انتشار در سیتوپلاسم میکند و فلوئورسانس (معمولاً سبز) منتشر میکند که با فرم انباشته در هنگامیکه میتوکندری فعال و سلامت است، متفاوت میباشد(معمولا قرمز). نسبت فلوئوروسانس قرمز به سبز برای تعیین عملکرد میتوکندری سلول استفاده میشود.
نکته: قسمت داخلی غشای میتوکندری داخلی دارای بار منفی است که فلوروکروم های کاتیونی را در آن نگهداری میکند.
این رنگ ها با ترکیبات مختلف مانند PI و FCCP برای ایجاد تمایز بین مرگ سلولی نکروزه و آپوپتوز و تمایز مراحل مختلف آپوپتوز استفاده میشوند.
Mitochondrial activity of streptolysin O permeabilized cells assay
درمان سلولها با استرپتولیزین O روی یخ یک روش ساده برای اندازهگیری سنتز ATP میتوکندری برای سنجش نفوذپذیری غشای پلاسما بدون آسیب رساندن به عملکرد میتوکندری میباشد. این روش MASC (mitochondrial activity of streptolysin O permeabilized cells) نامیده میشود و روشی ساده، سریع و حساس برای اندازهگیری سنتز ATP است. MASC درواقع، توقف سنتز ATP میتوکندریایی را که به دلیل اختلال عملکرد سلولی رخ میدهد، اندازه گیری میکند
Cytochrome c release detection
در طی آپوپتوز، سیتوکروم c از میتوکندری به سیتوزول منتقل میشود و با APAF1 تعامل میکند و پروکاسپاز 9 را به یک کمپلکس چند پروتئینی با سیتوکروم c و APAF1 به نام آپوپتوزوم جذب میکند. انتقال سیتوکروم c از میتوکندری به سیتوزول یک فرآیند ضروری است که آبشار کاسپازی را فعال میکند و منجر به آپوپتوز میشود.
اندازهگیری سیتوکروم c را میتوان با استفاده از تکنیکهای مختلف مانند، فلوسیتومتری ، الایزا، HPLC، اسپکتروفتومتری و وسترن بلات انجام داد.
در سنجش بر اساس فلوسیتومتری، سلولهای کشتشده با آنتیبادی مونوکلونال ضد سیتوکروم c یک شب انکوبه شده و با بافر بلاکینگ شسته میشوند. Alexa 488به عنوان یک فلوئوروکروم استفاده میشود که آزاد شدن سیتوکروم c از میتوکندری را با کونژوگه شدن با آنتی بادی مونوکلونال ضد سیتوکروم c تشخیص میدهد و در مقایسه با فلوئورسانس میتوکندری دست نخورده پیک فلورسانس نسبتاً کوچکتری نشان میدهد. این تکنیک سنجش معتبری برای آزادسازی سیتوکروم c در طول آپوپتوز میباشد.
روش های سنجش فعالیت کاسپاز ها:
آپوپتوز ممکن است از طریق مسیر درونی یا بیرونی شروع شود، اما در مسیر اجرایی هر دو مسیر همگرا میشوند، و با برش کاسپاز-3 ادامه مییابند. سرعت و مرحله آپوپتوز اغلب با استفاده از بررسی فعالیت کاسپازها مشخص میشود.
نکته: پیروپتوز نیز یک شکل وابسته به کاسپاز مرگسلولی میباشد.
کاسپازهای فعال از جمله نشانگرهای زیستی مرگ برنامهریزیشده سلولی محسوب میشوند. سیتوکراتین 18 (CK 18, M30) یک پروتئین برشخورده توسط کاسپازهاست و یکی از نشانگرهای زیستی آپوپتوز ناشی از شیمیدرمانی محسوب میشود. در طی آپوپتوز، پروتئینهای میانی (از جمله CK18) برای تجزیه سریع توسط کاسپازهای فعال 3، 7 و 9 هدف قرار میگیرند تا تولید اجسام آپوپتوز را تقویت کنند. M30 (Caspase Cleaved CK18) یک آنتیبادی اختصاصی است که در مراحل اولیه آپوپتوز ظاهر میشود و با سلول های دست نخورده یا نکروزه واکنش نشان نمیدهد، بنابراین تشخیص M30 یک شاخص قابل اعتماد برای آپوپتوز است و رنگ آمیزی ایمونولوژیک با آنتیبادی M30 با سایر روشهای سنجش آپوپتوز مانند TUNEL و ISEL همبستگی نشان دادهاست.
Fluorometric and colorimetric assays
کاسپاز 3 به عنوان عامل واسطهگر آپوپتوز درنظر گرفتهمیشود. کاسپاز-3 فعال PARP(poly ADP-ribose polymerase: آنزیمی که در ترمیمDNA ، یکپارچگی ژنوم و نظارت نقش دارد) را میشکافد. برش PARP توسط کاسپاز-3 در شروع آپوپتوز اتفاق میافتد و مهار برش PARP باعث کاهش آپوپتوز میشود. فعالیت کاسپاز-3 را میتوان از طریق تتراپپتید مصنوعی، DEVD (distinct amino acid sequence of Asp-GluVal-Asp)، که یا با یک مولکول فوئورسنت AFC (7-amino-4-trifuoromethylcoumarin)، یا مولکول رنگ سنجی pNA(p-nitroanilide) برچسبگذاری شدهاست، سنجش کرد.
FRET (Förster resonance energy transfer) یکیدیگر از کاوشگرهای فلوئورومتری برای تمایز بین مرگ سلولی آپوپتوز و نکروز است. FRET معمولاً در یک ژن ناقل ساخته میشود و نقش یک ژن گزارشگر را بازی میکند. FRET متشکل از پروتئین فلوئوروفور فیروزهای اهداکننده (CFP: cyan fluorescent protein) و پروتئین فلوئورسنت زرد پذیرنده (YFP: yellow fluorescent protein) است که با یک پیونددهنده اسیدآمینه کاسپازی فعال به نام DEVD به یکدیگر متصل شدهاند. پس از فعالشدن کاسپاز، پروتئینهای فلوئورسنت به صورت فیزیکی از هم جدا میشوند و فعالسازی کاسپاز با از دستدادن FRET پس از برش پروب آن مشاهده میشود. حفظ فلوئورسانس میتوکندری و از دستدادن پروب FRET قبل از برش تاییدکننده نکروز است. از آنجایی که نفوذپذیری میتوکندری و متعاقبا فعالسازی کاسپازها از ویژگیهای بارز آپوپتوز هستند، این روش ابزار بسیار حساسی را برای تشخیص و ارزیابی آپوپتوز و نکروز ایجاد میکند.
Immunohistochemical methods
ثابت شدهاست که آنتیبادیها ابزار مفیدی برای تشخیص شکل جداشده خاص از کاسپازهای مختلف از جمله کاسپاز-3 و 9 هستند.
Laser and mass spectroscopic methods
تشخیص فعالیت کاسپاز در سطح تکسلولی یک اندازهگیری بسیار حساس است. dcFCCS (Dual-color fluorescence cross-correlational spectroscopy) برای تشخیص فعالیت کاسپاز زمانی استفاده میشود که غلظت سوبسترا بسیار کم باشد (در حد نانومولار).
روش های سنجش فعالیت p53
p53 یک فسفوپروتئین هستهای است که با القای آپوپتوز یا توقف چرخهسلولی در فاز G1 نقش کلیدی در پاسخسلولی به آسیب DNA ایفا میکند. p53 آپوپتوز را از هر دو طریق مکانیسمهای وابسته به رونویسی و مستقل از رونویسی افزایش میدهد.
FASAY
FASAY (Functional analysis of separated alleles in yeast) یک سنجش عملکردی مبتنی بر مخمر است که فعالیت رونویسی را شناسایی میکند، که یک عملکرد ضروری برای فعالیت ضدتوموری p53 (نوع وحشی) میباشد. FASAY یک روش رنگسنجی است که برای تشخیص جهش p53 بسیار حساس، نیمه کمی و اختصاصی عمل میکند.
p53 protein analysis method
در بیشتر موارد، جهش در ژن p53 با تجمع پروتئین p53 ارتباط دارد. تشخیص پروتئین انباشتهشده به روش ایمونوهیستوشیمی (IHC) یا با روش الایزا انجام میشود که جز روشهای کمی برای تشخیص پروتئین p53 هستند.
روشهای تشخیص تکه تکه شدن / دناتوراسیون و تراکم DNA
قطعه قطعه شدن DNA به دلیل فعال شدن آبشار کاسپازها رخ میدهد. در واقع این فرآیند با فعال شدن اندونوکلئازها و تخریب پروتئین های هسته ای شروع میشود. فعال شدن اندونوکلئازها DNA کروموزومی را در بخش های بین نوکلئوزومی جدا میکند. تکه تکه شدن DNA یکی از علائم اصلی بیوشیمیایی مرگ برنامه ریزی شده سلولی است.
APO ssDNA assay
سنجش ssDNA APO از آنتی بادی تولیدشده علیه DNA تکرشتهای (ssDNA)، برای یافتن DNA آسیب دیده در سلول های آپوپتوتیک استفاده میکند.
TUNEL assay
تکه تکه شدن DNA با بوجود آمدن تعداد زیادی از رشته های DNA شکسته مشخص می شود و به عنوان یک استاندارد طلایی برای شناسایی مرگ برنامهریزیشده سلولی در نظر گرفته می شود. تکه تکه شدن DNA به قطعات 180-200 جفت بازی و بیش از kbp50 به عنوان یکی از ویژگی های بارز آپوپتوز شناخته میشود.
در روش TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated d-UTP Nick End Labelling) برای تشخیص شکستگی رشته DNA (DSBs: DNA strand breaks)، از نشانگذاری آنها به وسیله فلوئوروکروم ها استفاده میشود. در این روش سلول های آپوپتوتیک و نکروتیک با روش های سیتومتری و میکروسکوپی بر پایه فلوئورسانس، شناسایی و سنجش میشوند، که مبتنی بر شناسایی انتهای آزاد (انتهای 3’OH) DSB (بدون الگو) توسط TdT میباشد.
این روش به این ترتیب که: بافت موردنظر با پروتئاز پیش تیمار شده، انتهای آزاد با dUTP بیوتینیله نشاندار میشود و سپس TdT با پراکسیداز کونژوگه به آویدین رنگ آمیزی میشود، عملکرد خود را اجرا میکند.
نکته: به جای بیوتین یا دیگوکسیژنین، استفاده از Br-dUTP به عنوان کونژوگه با TdT حساسیت تست را افزایش میدهد و سیگنالهای چهار برابر قوی تر ارائه میدهد.
ISEL
ISEL (in-situ end labelling technique) سلولهای آپوپتوتیک، نکروتیک و سلولهای نشاندارشده را که DNA در آنها هنوز تکه تکه نشده و به نوکلئوزوم تبدیل نشده اند را شناسایی میکند. ISELدرواقع روش اصلاح شده TUNEL است که انتهای آزاد DNA را با مواد رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو نشاندار میکند.
ELISA
تکه تکه شدن DNA بلافاصله پس از ازدست دادن یکپارچگی غشای پلاسمایی رخ میدهد و باعث آزاد شدن هیستون ها (H1، H2A، H2B، H3 و H4) میشود که میتوان آنها را با روش الایزا سنجید. ELISA نوکلئوزومی یک روش حساس برای تشخیص تکه تکه شدن DNA است اما اختصاصی آپوپتوز نیست مگراینکه از روش سانتریفیوژ براساس شیب چگالی (differential centrifugation) نیز برای انتخاب DNA قطعه قطعه در آپوپتوز استفاده شود.
روش های بر پایه ی ژل الکتروفورزیس:
DNA Ladder assay
قطعه قطعه شدن DNA در آپوپتوز در دو مرحله اتفاق میافتد. DNA به طور متوالی شروع به تخریب میکند. در مرحله اول تکه تکه شدن قطعات DNA با وزن مولکولی بالا (50–300kbps) تولید میکند. در مرحله دوم، اندازه نسبتا کوچکتری از قطعات (180–200 bps) تولید میشود. این مرحله از تکه تکه شدن در سطح بین نوکلئوزومی رخ میدهد و منجربه تولید تک و الیگونوکلئوزوم ها میشود که با کمک روش DNA ladder assay قابل ارزیابی هستند.
Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
Field inversion gel electrophoresis
Single cell gel electrophoresis (comet assay)
روش های شناسایی اختصاصی DNA بر اساس فلوروکروم ها
تکهتکه شدن و ازدستدادن گسترده DNA را میتوان با اندازهگیری محتوای DNA با استفاده از رنگهای بینابینی مانند acridine orange ، ethidium bromide ، propidium iodide یا رنگهایی که از خارج به DNA متصل میشوند مانند Hoechst 33342، DAPI، YO-PRO-1 و میترامایسین شناسایی کرد.
فعال شدن یک اندونوکلئاز در طول مرگ برنامهریزیشده سلولی منجر به خروج DNA با وزن مولکولی کم بهدنبال افزایش نفوذپذیری سلولی میشود که در نتیجه توانایی رنگآمیزی سلولها با فلوئوروکرومهای اختصاصی DNA را کاهش میدهد. فرآیند تراکم DNA در طول آپوپتوز به صورت ویژه رخ میدهد، در حالی که نکروز هیچ رویدادی مانند تراکم DNA را نشان نمیدهد.
فلوئوروکرومهای اختصاصی DNA میتوانند زمانیکه غشای پلاسمایی کاهش جذب آنها را نشان دهد نیز آپوپتوز را شناسایی کنند. به عنوان مثال PI در مراحل اولیه آپوپتوز به دلیل غشای سلولی سالم نمیتواند وارد سلول شود هر چند مطالعات نشان دادهاند سلولهای آپاپتوتیک رنگشده باHoechst 33342 فلورسنس قویتری را نسبت به نمونه کنترل نشان میدهند.
به طورکلی، تشخیص آپوپتوز از طریق فلوئوروکرومهای اختصاصی DNA یک روش آسان، سریع، دقیق و کمی در سلولهای منفرد زنده و ثابت است، اما یک فرآیند چند مرحلهای است و برای بافتهای سالم، لازم است یک مرحله پیشتیمار با آنزیمها برای داشتن سلولهای منفرد انجام شود.
ارزیابی بالینی:
در شرایط بالینی، این روشها عمدتاً بر تصویربرداری رزونانس مغناطیسی (MRI: magnetic resonance imaging) تکیه میکنند که میتواند تغییرات در خواص انتشاری بافت یا توده تومور (DW-MRI) را ردیابی کند، در جاییکه بافت تحت تأثیر مرگسلولی قرار میگیرد، انتشار آب و به دنبال آن ضریب انتشار افزایش مییابد.
طیفسنجی رزونانس مغناطیسی (MRS: Magnetic resonance spectroscopy) نیز برای اندازهگیری غلظت لیپید و همبستگی نسبت چربی به آب برای سنجش مرگسلولی استفاده میشود.
سایر روشهای بالینی برای شناسایی آپوپتوز شامل نشانگذاری رادیویی با Annexin-V یا ترکیبات aposense و ردیابی جذب و توزیع زیستی آنها از طریق PET (positron emission tomography) یا SPECT (single photon-emission tomography) میباشد.