بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی استافیلوکوکوس اورئوس های مقاوم به متی سیلین (MRSA) با فلوسایتومتری

استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA) یکی از علل عفونت استاف است که درمان آن به دلیل مقاومت به برخی آنتی بیوتیک ها دشوار است. عفونت‌های استاف – از جمله عفونت‌های ناشی از MRSA – می‌توانند در بیمارستان‌ها، سایر مراکز مراقبت‌های بهداشتی، و در جامعه‌ای که در آن زندگی می‌کنید یا کار می‌کنید گسترش یابد. با توجه به شیوع گسترده این باکتری و همچنین درمان دشوار عفونت های ناشی از این باکتری، دانشمندان به دنبال روش های درمانی جدید و همچنین شناسایی الگوهای مقاومت دارویی این باکتری هستند.

اکتینومیسیت‌ها باکتری‌هایی گرم مثبت و رشته ای هستند که بخش بزرگی از میکروارگانیسم‌های خاک را شامل می‌شوند. بر اساس مطالعات، سه چهارم کل آنتی‌بیوتیک‌ها را اکتینومیسیت‌ها تولید می کنند. در این خانواده, جنس استرپتومایسس از اهمیت خاص دارد. اکوسیستم های حرا منبع بسیار ناشناخته ای برای اکتینومیست‌ها با توجه به تولید متابولیت‌های ثانویه فعال دارویی هستند و از نظر اقتصادی و بیوتکنولوژیکی با ارزش ترین پروکاریوت‌ها هستند.

گونه‌های استرپتومایسس در حال تولید طیف گسترده‌ای از محصولات طبیعی با فعالیت‌های زیستی هستند. متابولیت‌های مشتق شده از این گونه‌ها ویژگی خاصی برای مبارزه با پاتوژن‌های مقاوم به داروی ضد میکروبی دارند.  جنس استرپتومایسس به دلیل ظرفیت منحصر به فرد خود برای سنتز متابولیت‌های ثانویه جدید با طیف گسترده‌ای از فعالیت های بیولوژیکی از اهمیت تجاری برخوردار است. آن‌ها اسپورهای فراوان و به راحتی پراکنده می‌کنند و به خوبی با زیستگاه‌های مختلف از جمله محیط‌های دریایی سازگار است.

تشخیص الگوی مقاومت میکروبی با فلوسایتومتری

کشت باکتری های MRSA در فاز لگاریتمی (OD600=0.5) با ترکیب ضدباکتری خالص به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تیمار شد. سه غلظت بازدارندگی حداقل متفاوت (1×MIC×7, MIC×3 ,MIC) و دی متیل سولفوکسید (DMSO) به عنوان کنترل حلال استفاده شد. متعاقباً سلول های تیمار نشده و تیمار شده با سانتریفیوژ با دور 5000 به مدت 10 دقیقه جمع آوری و دو بار با PBS شسته شدند. پس از شستشو، سلول‌ها با 10 میکرولیتر آکریدین اورنج از (10.0 میلی گرم در میلی لیتر استوک) رنگ آمیزی شدند و به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. پس از آن، سلول ها با 1 میکرولیتر یدید پروپیدیوم از (1.0 میلی گرم در میلی لیتر استوک) رنگ آمیزی شدند و به مدت 5 دقیقه در شرایط تاریک نگهداری شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی 10 میکرولیتری به صورت آسپتیک به لام میکروسکوپی منتقل شدند و با یک ورقه پوششی پوشانده شدند. سلول ها در زیر میکروسکوپ فلورسانس با محدوده فیلتر 480 نانومتر و 567 نانومتر، بزرگنمایی 20× مشاهده شدند.

در آنالیز فلوسایتومتری، از غلظت فوق الذکر از ترکیب ضد میکروبی برای درمان کشت فاز لگاریتمی MRSA به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد استفاده شد. پس از شستشو با بافر PBS، سلول‌ها با پروپیدیوم یدید (میلی گرم در میلی لیتر استوک) رنگ آمیزی شدند و به مدت 5 دقیقه در شرایط تاریک نگهداری شدند. نمونه‌های سلولی رنگ‌آمیزی شده با PI برای آسیب غشای سلولی MRSA با استفاده از فلوسیتومتری FACS Calibur (BD Biosciences، آکسفورد، انگلستان) و نتایج با نرم‌افزارCell Quest Pro ، تجزیه و تحلیل شدند. این آزمایش در سه تکرار انجام شد.

نتایج

این بیست جدایه مختلف تحت 9 پوشش اصلی گروه‌بندی شدند. در بین این سویه‌ها، جدایه‌های JRG-02، JRG-03، JRG-04، JRG-10 و JRG-12 فعالیت ضد باکتریایی وسیع الطیف علیه استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA) و باکتری‌های گرم منفی Klebsiella p از خود نشان دادند. علاوه بر این، تولید ترکیب ضد باکتریایی و خواص آن را از ایزوله JRG-02، یک نامزد دارویی بالقوه، مشخص شد.

تجزیه و تحلیل آسیب غشای سلولی MRSA را با استفاده از رنگ‌های رنگ‌آمیزی اسید نوکلئیک مانند (AO) و (PI) بررسی شد.

1. رنگ نفوذپذیر غشایی AO، به تمام سلول‌های مرده و زنده نفوذ می‌کند و به رنگ سبز نشان داده می‌شود. پروپیدیوم یدید رنگی غیرقابل نفوذ غشایی است که به سلول‌های مرده متصل می‌شود و به رنگ فلورسانس می‌شود.
2. افزایش تعداد سلول‌های زنده (رنگ سبز) در سلول‌های MRSA تیمار نشده (شکل 5 a: i, ii, iii) در مقایسه با سلول‌های تیمار شده مشاهده شد.
3. در مقابل، 14.4 درصد سلول‌های مرده در غلظت 1× MIC (7.5 گرم در میلی لیتر) پس از قرار گرفتن در معرض ترکیب زیست فعال (JGP1) به مدت 3 ساعت (شکل 5b i, ii, iii)  مشاهده شد.
4. درمان ترکیبی در غلظت های بالاتر از MIC مانند 3× MIC 7.5  µg mL, and 7× MIC 17.5  µg mL)) برای 3 ساعت افزایش آسیب غشای سلولی و به دنبال آن مرگ سلولی 18٪ (شکل 5 c: i, ii, iii) و 79٪ (شکل 5 d: i, ii, iii) را به ترتیب نشان داد.

شکل: سلول های MRSA با آنالیز فلوسایتومتری با PI رنگ آمیزی شدند. 5a(i)، 5a(ii) و 5a(iii) درمان نشدند و 5b(i)، 5b(ii) و 5b(iii) با 1× MIC درمان شدند. 5c (i)، 5c (ii)  و 5c (iii) با 3× MIC   و 5d (i)، 5d (ii) و 5d (iii) با غلظت  7× MIC  از ترکیب فعال زیستی JGP1 تیمار شدند.

گزارش میکروسکوپ فلورسانس حاضر نشان داد که اثر کشنده ترکیب فعال عمدتاً به روشی وابسته به غلظت است (شکل 6a-6d).

شکل: سلول های MRSA رنگ آمیزی شده با AO/PI با میکروسکوپ فلورسنت تصویربرداری شده است. به ترتیب (6a) تیمار نشده، (6b) 1× MIC، (6c) 3× MIC و (6d) 7× MIC از غلظت JGP1 تیمار شده اند.

نتیجه گیری

این مطالعه  نشان داد که بقای کلونیزه شده متنوع استرپتومایسس در رسوبات حرا با فعالیت بیولوژیکی و تنوع ژنتیکی بالقوه است. Streptomyces sp. JRG-02 یک آنتی بیوتیک قوی و موجودیت شیمیایی متمایز با فعالیت ضد باکتریایی قابل توجه در برابر MRSA است. ترکیب فعال زیستی پتانسیل شکستن غشای سلولی MRSA را داشت. تصاویر میکروسکوپی فلورسانس و تجزیه و تحلیل FACS پیش‌بینی می‌کنند که جذب PI توسط سلول‌ها ممکن است زیرا PI می‌تواند به DNA سلول‌های در معرض غشاء متصل شود. ویژگی‌های ساختاری بیشتر این مولکول‌ها، استفاده از این اصل فعال را به‌عنوان سرنخ در مورد کشف دارو برای ریشه‌کن کردن میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا مقاوم به داروی عفونی در حال ظهور، ترویج می‌کند.

منبع

Govindarajan G, Mullick P, Raj BA, Kumar PS, Al-Ansari MM, Ilavenil S, Solomon RD. Susceptibility pattern of methicillin resistance Staphylococcus aureus (MRSA) by flow cytometry analysis and characterization of novel lead drug molecule from Streptomyces species. Journal of Infection and Public Health. 2021 Dec 1;14(12):1831-41.