مقدمه ای بر ایمونوهیستوشیمی (IHC)

ایمونوهیستوشیمی (IHC) یک تکنیک آزمایشگاهی قدرتمند است که شامل استفاده از آنتی بادی ها برای شناسایی آنتی ژن های خاص در بافت ها و سلول ها می شود. هدف IHC شناسایی و تجسم توزیع و محلی سازی پروتئین ها، کربوهیدرات ها و سایر مولکول های زیستی در یک بخش از بافت است. با بهره برداری از ویژگی ذاتی برهمکنش آنتی بادی-آنتی ژن، IHC به محققان اجازه می دهد تا اطلاعات کمی و کیفی در مورد بیان پروتئین و ترکیب سلولی در بافت به دست آورند.کاربرد IHC در تحقیقات پایه، تشخیص بیماری، و توسعه دارومی باشد. در تحقیقات، ابزاری ضروری برای بومی‌سازی پروتئین‌ها، درک عملکرد آن‌ها و آشکارسازی بینش‌های فرآیندهای بیولوژیکی است. در پاتولوژی تشخیصی، IHC به طور معمول بر روی نمونه های بافت بیمار برای شناسایی نشانگرهای مرتبط با سرطان و سایر بیماری ها انجام می شود. همچنین نقش حیاتی در توسعه داروهای جدید ایفا می کند و به ارزیابی تاثیر درمان ها بر اهداف مولکولی کمک می کند.IHC  ریشه در دهه 1930 دارد، زمانی که آلبرت کونز برای اولین بار آنتی بادی ها را با رنگ های فلورسنت برای تشخیص آنتی ژن ها در بافت ها کونژوگه کرد. از آن زمان، تکنیک‌های IHC برای استفاده از آنتی‌بادی‌های مرتبط با آنزیم و سیستم‌های مختلف تشخیص کروموژنیک تکامل یافته‌اند که یک رسوب رنگی تولید می‌کنند که نشان‌دهنده محلی‌سازی آنتی‌ژن است. پیشرفت‌ها در بازیابی آنتی ژن، تقویت سیگنال و اتوماسیون، IHC را به یک تکنیک تحلیلی قابل دسترس، بسیار حساس و همه‌کاره تبدیل کرده است که در سطح جهانی در آزمایشگاه‌ها و کلینیک‌ها استفاده می‌شود.

اصول ایمونوهیستوشیمی

ایمونوهیستوشیمی بر اتصال خاص آنتی بادی ها به آنتی ژن ها در بافت ها و سلول ها متکی است. از اصول اولیه برهمکنش های آنتی بادی-آنتی ژن و تشخیص آنتی بادی استفاده می کند.آنتی بادی ها پروتئین هایی هستند که توسط سیستم ایمنی تولید می شوند و می توانند مولکول های هدف خاصی به نام آنتی ژن را شناسایی کرده و به آن ها متصل شوند. آنتی بادی حاوی یک ناحیه پاراتوپ است که مکمل اپی توپ یا عامل تعیین کننده آنتی ژن روی آنتی ژن است. این به آنتی بادی اجازه می دهد تا به طور خاص از طریق یک تعامل نوع قفل و کلید به آنتی ژن هدف خود متصل شود.در ایمونوهیستوشیمی، از آنتی بادی های اولیه استفاده می شود که آنتی ژن های پروتئینی خاص موجود در نمونه بافت را هدف قرار داده و به آن متصل می شوند. پس از شستن هر آنتی بادی غیر متصل، یک آنتی بادی ثانویه استفاده می شود که آنتی بادی اولیه را می شناسد و به آن متصل می شود. این آنتی بادی ثانویه از نظر شیمیایی به یک مولکول گزارشگر مانند یک آنزیم، رنگ فلورسنت یا بیوتین مرتبط است.رایج ترین آنزیم های مورد استفاده در IHC پراکسیداز و آلکالن فسفاتاز می باشند که جهت نشاندار کردن آنتی بادی ثانویه از آن ها استفاده می شود این آنزیم ها می توانند واکنش ها را با سوبستراهای اضافه شده به نام کروموژن کاتالیز کنند و منجر به رسوب محصولات رنگی در محل آنتی ژن شوند. برخی از کروموژن‌های متداول مورد استفاده که رنگ‌های قابل مشاهده را تولید می‌کنند عبارتند از 3،3′-دی‌آمینوبنزیدین (DAB)، 3-آمینو-9-اتیل کاربازول (AEC) . روش دیگر، رنگ های فلورسنت کونژوگه به ​​آنتی بادی ثانویه می تواند برای تشخیص استفاده شود. اینها شامل فلورسئین، الکسا فلورس و رنگهای DyLight هستند. سپس سیگنال فلورسنت را می توان با استفاده از فلورسانس یا میکروسکوپ کانفوکال مشاهده کرد.

آماده سازی نمونه

آماده سازی نمونه مناسب اولین گام حیاتی در ایمونوهیستوشیمی برای حفظ مورفولوژی بافت، حفظ اپی توپ های  آنتی ژن هدف و امکان برش نازک است. مراحل اصلی آماده سازی نمونه عبارتند از:

1. تثبیت بافت

تثبیت، ساختار بافت را حفظ می کند و اجزای سلولی را در حالت in vivo تثبیت می کند. فرمالین 10 درصد بافری رایج ترین تثبیت کننده بافت می باشد، این تثبیت کننده از طریق پل های متیلن به پروتئین ها متصل می شود. تثبیت طولانی مدت ممکن است آنتی ژن را از دسترس خار کند بنابراین زمان مناسب جهت تثبیت بافت توصیه می شود که این زمان بسته به نوع بافت متغیر است.

2. قالب گیری (Embedding)

پس از تثبیت، بافت ها در یک محیط جامد قرار می گیرند تا امکان برش داده شود. رایج ترین ماده قالب گیری موم پارافین است که در دمای 60-58 درجه سانتی گراد به بافت ها نفوذ می کند. سایر مواد قالب گیری مانند کرایومدیا، ژلاتین و پلاستیک نیز برای کاربردهای مختلف استفاده می شوند. Embedding مورفولوژی و سازماندهی بافت را حفظ می کند.

3. برش گیری (Cutting)

بافت های تعبیه شده با استفاده از میکروتوم به برش های نازک تقسیم می شوند. بخش ها معمولاً با ضخامت 3-5  میکرومتر برش داده می شوند و روی لام های شیشه ای پوشیده شده با چسبی مانند پلی ال-لیزین یا آمینوپروپیل تری اتوکسی سیلان شناور می شوند. مقاطع نازک برای نفوذ آنتی بادی و اتصال آن به آنتی ژن ضروری است.

4. آماده سازی اسلاید

برای حذف پارافین از روی لام های تهیه شده از آون 100 درجه و حلال های آلی مانند زایلن قبل از هیدراتاسیون مجدد از طریق الکل درجه بندی شده به آب استفاده می شود. سپس بخش ها برای بازیابی آنتی ژن و رنگ آمیزی IHC آماده می شوند. آماده سازی خوب اسلاید، مورفولوژی بافت را حفظ می کند و به بخش ها اجازه می دهد تا به لام ها بچسبند.آماده سازی مناسب نمونه از طریق تثبیت استاندارد بافت، قالب گیری، برش و آماده سازی اسلاید کیفیت نمونه و بهینه سازی نتایج IHC را تضمین می کند.

5. بازیابی آنتی ژن

بازیابی آنتی ژن یک مرحله مهم در ایمونوهیستوشیمی برای شناسایی آنتی ژن ها در بخش های بافتی است که ممکن است در طول فرآیند تثبیت و قالب گیری بافت، تغییر یافته یا پوشیده شده باشند. تثبیت ، بافت ها را از نظر شیمیایی حفظ می کند، اما همچنین می تواند ساختار پروتئین را تغییر دهد و مکان های آنتی ژنی را بپوشاند و آنها را برای آنتی بادی ها غیرقابل تشخیص کند. هدف بازیابی آنتی ژن شکستن این پیوندهای متقابل پروتئین و از بین بردن پوشش آنتی ژن ها برای تقویت اتصال آنتی بادی و رنگ آمیزی ایمنی است.

دو روش اصلی برای بازیابی آنتی ژن وجود دارد:

بازیابی اپی توپ ناشی از گرما (HIER)

HIER از گرما برای شکستن پیوندهای متقاطع تشکیل شده در طول تثبیت و امکان بازیابی آنتی ژن ها استفاده می کند. برش‌های بافت در محلول‌های مختلفی مانند بافر سیترات، EDTA یا بافر تریس در دماهای بالاتر از 90 درجه سانتی‌گراد تا 121 درجه سانتی‌گراد با استفاده از زودپز، بخارپز، ا مایکروویو یا حمام آب گرم بازیابی می‌شوند این مکانیسم گرمایشی احتمالا سبب شکستن پیوندهای هیدروژنی و فعل و انفعالات آبگریز می شود که مکان های اتصال آنتی بادی را مسدود می کند. HIER ساده، سریع و پرکاربرد است. با این حال، می تواند باعث تغییرات مورفولوژی بافت در دماهای بسیار بالا شود.

بازیابی اپی توپ آنزیمی

این روش از آنزیم‌های پروتئولیتیک مانند تریپسین، پپسین یا پروتئیناز K برای شکستن پیوندهای متقابل ناشی از فرمالدئید و آشکار کردن مکان‌های آنتی ژنی برای اتصال آنتی‌بادی استفاده می‌کند. بازیابی آنتی ژن خفیف تری را با تغییرات مورفولوژیکی کمتر ارائه می دهد. با این حال، درمان آنزیمی نیاز به بهینه سازی دقیق نوع آنزیم، غلظت، زمان انکوباسیون و دما دارد تا از هضم بیش از حد که می تواند مورفولوژی بافت و آنتی ژن ها را از بین ببرد، جلوگیری شود.

به طور خلاصه، بازیابی آنتی ژن،  آنتی ژن پروتئین های تغییر یافته توسط تثبیت فرمالین را بازیابی می کند، بنابراین حساسیت و اثربخشی ایمونوهیستوشیمی برای تشخیص و تحقیق بیماری را به طور چشمگیری بهبود می بخشد. انتخاب دقیق روش به تعادل بازیابی آنتی ژن بهینه با مورفولوژی بافت حفظ شده کمک می کند.

6. مسدود کردن و انکوباسیون آنتی بادی

یک مرحله مهم در ایمونوهیستوشیمی مسدود کردن و انکوباسیون آنتی بادی است. برای جلوگیری از رنگ آمیزی مثبت کاذب، ابتدا مکان های اتصال غیر اختصاصی روی نمونه بافت مسدود می شود. می توان از چندین محلول مسدود کننده مانند سرم طبیعی از همان گونه آنتی بادی ثانویه استفاده کرد. پروتئین های موجود در سرم به مکان های غیر اختصاصی متصل می شوند و مانع از اتصال آنتی بادی ثانویه می شوند. پس از انسداد، بافت با آنتی بادی اولیه انکوبه می شود. این آنتی بادی به طور خاص به آنتی ژن هدف متصل می شود. آنتی بادی اولیه در یک محلول بافر رقیق شده و بسته به پروتکل سازنده آنتی بادی انکوبه می شود. دما و زمان انکوباسیون بر میل اتصال تأثیر میگذارد. پس از انکوباسیون، آنتی بادی اولیه اضافی شسته می شود. سپس نمونه با یک آنتی بادی ثانویه علیه آنتی بادی اولیه انکوبه میشود. این آنتی بادی ثانویه برای تولید یک سیگنال قابل تشخیص، مانند رنگ یا آنزیم فلورسنت، کونژوگه یا برچسب گذاری می شود. انکوباسیون آنتی بادی ثانویه معمولاً 30-60 دقیقه طول می کشد. آنتی بادی ثانویه رنگ آمیزی را تقویت می کند و امکان تجسم را فراهم می کند. مجدداً، آنتی بادی ثانویه اضافی غیر متصل پس از انکوباسیون شسته می شود.

انسداد مناسب و انکوباسیون آنتی بادی برای رنگ آمیزی تمیز و خاص با حداقل پس زمینه بسیار مهم است. بهینه سازی این مراحل به اطمینان از تفسیر دقیق نتایج ایمونوهیستوشیمی کمک می کند. غلظت، زمان انکوباسیون، دما و شستشو برای هر آنتی بادی باید کالیبره و تایید شود.