کارگاه SDS-PAGE و وسترن بلات

SDS-PAGE و وسترن بلات در سلول بافت آزما

---

مدت:  3 روز
از ساعت 9 صبح تا 14 

(امکان تغییر ساعت با توافق مدرس و اعضا)

ظرفیت: 5 نفر (نیمه خصوصی)

هزینه ثبت نام: 5.900.000
۴.۷۰۰.۰۰۰

واریز  مبلغ به شماره کارت:                    ۶۲۲۱۰۶۱۲۰۹۲۵۷۳۵۳                      به نام سلول بافت زیست
شماره شبا: IR130540103602100019400007

 

 اصول و مبانی تئوری و عملی SDS-PAGE و وسترن بلات 

سرفصل‌ها 

اصول و مبانی تئوری و عملی SDS-PAGE
کاربرد SDS-PAGE
مواد و تجهیزات لازم
تهیه ژل stacking و resolving
آماده‌سازی نمونه
لودینگ نمونه و ران کردن دستگاه
رنگ‌آمیزی و رنگ‌بری ژل
آنالیز نتایج

اصول و مبانی تئوری و عملی وسترن بلات

کاربرد وسترن بلات
 استخراج پروتئین
 انواع غشا
 متد‌های مختلف ترانسفراسیون
انتقال پروتئین از ژل به غشا PVDF
تهیه transfer sandwich
بلاکینگ
انکوباسیون توسط آنتی‌بادی
آنالیز نتایج

جهت اطلاع از تاریخ دوره و هزینه سایر دوره‌ها دکمه ثبت نام را زده و در فرم ثبت نام اطلاعات به تفکیک دوره قید شده است.

جهت ارتباط مستقیم با بخش وسترن بلات با شماره  02188332915 تماس حاصل فرمایید.

 

کارگاه SDS-PAGE و  Western-Blot

تکنیک SDS-PAGE، یک روش الکتروفورز ژل است که برای جداسازی پروتئین استفاده می شود. رایج‌ترین فناوری مورد استفاده جهت تحلیل و بررسی مراحل خالص سازی و همچنین تعیین وزن مولکولی پروتئین ها تکنیک SDS-PAGE (الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید دودسیل سولفات سدیم) است. به دلیل استفاده از ماده سدیم دودسیل سولفات (SDS) و همچنین ویژگی های عالی ژل پلی اکریل آمید در تکنیک SDS-PAGE قدرت تفکیک پروتئین ها بسیار عالی می باشد. در تکنیک SDS-PAGE پروتئین هایی که  الکتروفورز شده اند و براساس اندازه در ژل پلی اکریل آمید مرتب می شوند. استفاده ترکیبی از سدیم دودسیل سولفات (SDS) و ژل پلی اکریل آمید اجازه می دهد تا تأثیر ساختار و بار را از بین ببریم و پروتئین ها تنها بر اساس تفاوت در وزن مولکولی آنها جدا شوند.
 
در تکنیک SDS-PAGE هنگامی که پروتئین ها از نمونه استخراج می شوند، روی ژل ساخته شده از SDS و پلی اکریل آمید اجرا می شوند. SDS یک ماده شوینده آنیونی است که برای خطی کردن پروتئین ها (پروتئین های دناتوره) و ایجاد بار منفی به پروتئین های خطی شده متناسب با جرم مولکولی آنها استفاده می شود.
پلی اکریل آمید به تکیه گاه جامد ژل تبدیل می شود. پروتئین های دناتوره شده که دارای بار منفی هستند از طریق ژل به سمت انتهای مثبت مهاجرت می کنند. با توجه به اندازه پروتئین ها، سرعت مهاجرت بین پروتئین ها متفاوت است و جداسازی اتفاق می افتد. بنابراین، تکنیک SDS-PAGE برای جداسازی تک تک پروتئین ها بر اساس اندازه آنها مفید و موثر است.

 

وسترن بلات (گاهی اوقات ایمونوبلات نامیده می شود)، یک تکنیک تحلیلی پرکاربرد در زیست شناسی مولکولی و ایمونوژنتیک برای تشخیص پروتئین های خاص در نمونه ای از بافت هموژن یا عصاره های متفاوت است. علاوه بر شناسایی پروتئین ها، این تکنیک همچنین برای تشخیص و تعیین کمیت پروتئین های مختلف در یک ترکیب پروتئینی پیچیده استفاده می شود. این تکنیک از سه مرحله اصلی برای انجام این کار استفاده می کند:

(1) جداسازی بر اساس اندازه،

(2) انتقال به یک بستر جامد و

(3) علامت گذاری پروتئین هدف با استفاده از یک آنتی بادی اولیه و ثانویه مناسب برای رویت اینتراکشن پروتئین و آنتی بادی اختصاصی آن

 

در این تکنیک یک آنتی بادی مصنوعی یا مشتق از حیوان (که به عنوان آنتی بادی اولیه شناخته می شود) تهیه می شود که پروتئین هدف را شناسایی کرده و به آن متصل می شود. سپس یک آنتی بادی ثانویه اضافه می شود که آنتی بادی اولیه را می شناسد و به آن متصل می شود. آنتی بادی ثانویه از طریق روش‌های مختلفی مانند رنگ‌آمیزی، ایمونوفلورسانس و رادیواکتیویته قابل مشاهده است که امکان تشخیص غیرمستقیم پروتئین هدف را فراهم می‌کند.

 

سایر تکنیک‌های مرتبط شامل آنالیز دات بلات، بلات کمی، ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی است که در آن از آنتی‌بادی‌ها برای شناسایی پروتئین‌ها در بافت‌ها و سلول‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی ایمنی، و سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) استفاده می‌شود.

 

وسترن بلات به طور گسترده در حیطه ی بیوشیمی برای تشخیص کیفی پروتئین های هدف و تغییرات پروتئینی (مانند تغییرات پس از ترجمه) در تحقیقات استفاده می شود. تخمین زده می شود که حداقل 8 تا 9 درصد از تمام نشریات مرتبط با بررسی پروتئین ها، وسترن بلات را جز تکنیک های خود استفاده میکنند. این تکنیک به عنوان یک روش کلی برای شناسایی حضور یک پروتئین هدف در یک مخلوط پیچیده از پروتئین ها استفاده می شود. اندازه ی نیمه کمی از یک پروتئین را می توان از اندازه و شدت رنگ یک نوار پروتئینی روی غشای بلات به دست آورد.

 

وسترن بلات به طور معمول برای تایید تولید پروتئین پس از کلونینگ استفاده می شود. همچنین در تایید تشخیص های پزشکی، به عنوان مثال، در آزمایش HIV،(جنون گاوی) BSE-Test، HBV و کروتزفلد-جاکوب استفاده می شود.

 

یکی از مراحل مهم در وسترن بلات کمی سازی است. این مرحله به دو دلیل انجام میشود؛ اول، میزان کمی پروتئین در هر عصاره ی پروتئینی های متفاوت است. قبل از اینکه بتوان مقایسه دقیق تری انجام داد، این تفاوت ها باید استاندارد شوند. دوم، از آنجایی که سیگنال تولید شده از باند پروتئینی در اخرین مرحله، خطی نیست، نباید از آن برای مدل سازی غلظت استفاده شود. 

تکنیک وسترن بلات

در نهایت وسترن بلات یک تست تاییدی برای تکنیک SDS-PAGE می‌باشد و می توان به عنوان یک فرایند پیچیده در نظر گرفت، زیرا محقق تلاش می‌کند یک سیگنال اختصاصی و درعین حال قوی را دریافت کند.